尖銳溼疣五大檢查手段
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一、醋酸白試驗
用3-5%醋酸外塗疣體2-5分鐘,病竈部位變白稍隆起,肛門病損可能需要15分鐘。本試驗的原理是蛋白質與酸凝固變白的結果,HPV感染細胞產生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產生的不同,只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高,它比常規檢測觀察組織學變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規則。美國CDC提示,醋酸白試驗並不是特異試驗,且假陽性較常見。
二、免疫組織學檢查
常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法(即PAP),顯示溼疣內的病毒蛋白,以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時,尖銳溼疣的淺表上皮細胞內可出現淡紅色的弱陽性反應。
三、組織化學檢查
取少量病損組織製成塗片,用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原,則抗原抗體結合。在過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)方法中,核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速,對診斷有幫助。
四、病理檢查
主要爲角化不全,棘層高度肥厚,乳頭瘤樣增生,表皮突增厚,延長,其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞並有相當數量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規則,且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點爲粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大,胞漿着色淡、中央有大而圓,深嗜鹼性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較緻密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳溼疣,表皮極度向下生長,代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混,故須多次活檢。若有緩慢發展之傾向, 則爲一種低度惡變的過程,即所謂疣狀癌。
五、基因診斷
迄今,HPV難於用傳統的病毒培養及血清學技術檢測,主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點,爲HPV檢測開闢了新途徑。
(一)標本的採集及處理
1.標本的採集和預處理:用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時,將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中,用PBS離心(3000g,10min)洗滌2次,沉積細胞重懸於1mlPBS中,取0。5ml細胞懸液抽提DNA。
2.標本核酸的提取:按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,10mmol/L EDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS,1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1),氯仿/異戊醇(24:1)各抽提2次;加1/10體積3mol/L NaAc(pH 5.2)及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉澱DNA;加1體積乙醇洗滌1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.0mmol/L EDTA)溶解DNA,37℃溫育30min。
(二)PCR擴增
1. 引物設計和合成:HPV基因組可分爲早期區(E)和晚期區(L),每區含一系列開放讀碼框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1,該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列,也可擴增其它型HPV。
反應試劑:Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP貯備液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L),10×PCR緩衝液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5),100μmol/L MY11和MY09貯備液,滅菌的玻璃蒸餾器製備的蒸餾水。
擴增方法和程序:以100μl PCR反應液,用無菌0。5ml硅化塑料離心管爲反應管進行擴增反應。
(1)實驗前配製預混反應試劑並分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。
(2)各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。
(3)加入80-100μl石蠟油,在臺式離心機上快速離心數秒鐘,使各反應試劑收集於油層下。目前,PCR試劑已商品化,反應體積爲25μl。使用時只加入標本DNA即可。
(4)將反應管置PCR擴增儀上,循環參數爲95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 50s循環35次,最後72℃延伸5min。
4.每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒(每反應爲100pg)或含有HPV的細胞系(如Caski、HeLa)DNA爲陽性對照,以無HPV的人細胞系DNA爲陰性對照。
(三)擴增產物的檢測和分析
1. 凝膠電泳:擴增反應結束後,取出反應管,冷卻至室溫,取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳,溴化乙錠染色,紫外分析儀下分析結果,分子量約爲450bp處出現明顯的DNA帶。
2. 核酸雜交:如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時,可用標記的公用混合探針和(或)型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。
按照標準方法制32P ATP標記的寡核苷酸探針,需達到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振盪下雜交2-3h,隨後於30-55℃下用洗滌液(2×SSC、0.1%SDS)迅速沖洗雜交膜,除去多餘探針。然後進行洗膜,其條件依所用探針而異:公用混合探針,55℃洗膜10min;MY12、MY13及MY16探針,56-57℃下10 min,並換液重洗1次;MY14及WD74探針,58-59℃下10min,亦換液重洗1次。
用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高,GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果,可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA,若以核酸雜交檢測PCR產物,敏感性提高,能檢出10個拷貝的HPV DNA。
鑑於PCR技術的高度敏感性,以生殖道脫落細胞爲檢材足以滿足試驗要求,避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下,PCR擴增產物經凝膠電泳,觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此,PCR技術檢測HPV實驗週期短、簡便快速。
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